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　　小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA實驗說明

　　檢測范圍：

　　25 ng/L-800 ng/L

　　使用目的：

　　本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。

　　實驗原理：

　　本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α(TNF-α)，再與HRP標記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹-底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。

　　標本要求 ：

　　1.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

　　2.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步驟：

　　1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

　　800 ng/L5號標準品150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

　　400 ng/L4號標準品150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

　　200 ng/L3號標準品150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

　　100 ng/L2號標準品150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

　　50 ng/L1號標準品150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

　　2.加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

　　5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

　　6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

　　7.溫育：操作同3。

　　8.洗滌：操作同5。

　　9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

　　10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

　　11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司