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　　凍存試劑、樣品可以室溫或37℃水浴解凍嗎?

　　凍存試劑或樣品的解凍，如果時(shí)間比較充裕，建議在冰浴或冰水浴上緩慢解凍。如果時(shí)間比較著急，大多數(shù)凍存的試劑或樣品是可 以在室溫或37℃水浴解凍(例如抗生素一些產(chǎn)品不建議客戶37度水浴)，但都必須特別小心，必須邊觀察、邊輕輕晃動(dòng)、邊融解。待 部分溶解后即需從水浴中取出，確保溶解過程中試劑或樣品還是接近0℃的。如果該試劑或樣品在0℃不會結(jié)凍，解凍后可以置于冰浴或冰水浴。

　　為了使生物樣品在一定的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，人們按不同需求將樣品保存在4℃，-20℃，-80℃ 或溫度更低的冰箱中，或者保存在液氮中。本生本文談?wù)勆�物樣品低溫保存尤其是凍存時(shí)需要注意的一些問題。

　　1. 保存的組織樣品要盡快凍存

　　樣品貯存的溫度對有效保存時(shí)間的影響很大。選擇合適的貯存方式和貯存溫度很重要。但為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性，研究者也要充分注意樣品在貯存或固定的處置時(shí)間和方式。樣品從開始收獲到固定或低溫保存這段時(shí)間，仍有一些生化過程在較快地進(jìn)行。這些生化反應(yīng)的速度直到樣品被固定或者低溫保存時(shí)才顯著降低。這一段時(shí)間越短越好。對于手術(shù)切除的組織，熱缺血(warm ischemia)時(shí)間越短越好;對于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，處死取樣時(shí)掙扎時(shí)間越短越好。這有助于防止因環(huán)境改變而導(dǎo)致基因表達(dá)水平或蛋白磷酸化狀態(tài)產(chǎn)生較大變化。一些較復(fù)雜的手術(shù)可能進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)甚至整天，那么被切割但未被切離的那部分組織可能經(jīng)歷較長的熱缺血時(shí)間，從而導(dǎo)致較大的生化變化。為了盡可能減少熱缺血的影響，一些手術(shù)室門放置了液氮容器，組織一旦切下就被投入液氮進(jìn)行急凍(snap freezing);對于耗時(shí)較長的手術(shù)，有人先在短時(shí)間內(nèi)切下有代表性的小部分組織用于研究，然后再進(jìn)行耗時(shí)較長的切除;有人在條件有，采用了將熱缺血狀態(tài)轉(zhuǎn)為冷缺血(cold ischemia )狀態(tài)的辦法減少樣品的變化。他們先把切下的組織置于冰上或4℃ 冰箱中放置短時(shí)間，方便時(shí)再將樣品置于-80 ℃冰箱或液氮保存�？傊�，從樣品開始采集到被凍存或固定，這段時(shí)間越短越好，一般不要超過20分鐘。當(dāng)然不同組織生化過程的變化快慢有異。當(dāng)組織來不及凍存時(shí)，可將其剪成小塊，放于組織保存液如RNAsafety?中。

　　2. 樣品凍存的優(yōu)缺點(diǎn)

　　相比于FFPE樣品，凍存組織的DNA 和RNA的得率高，片段長，質(zhì)量好�？捎糜诨�因芯片和新一代測序等高通量基因組學(xué)檢測。不同于FFPE樣品，凍存組織內(nèi)的蛋白質(zhì)(如酶類)仍然保持生物活性，可用于某些檢測。但對凍存樣品，需要注意一些問題。凍存組織的形態(tài)學(xué)檢測效果有時(shí)不如FFPE樣品精細(xì)、(例如用于免疫組織化學(xué)檢測時(shí));某些病理組織內(nèi)的一些感染性因子凍存后仍然保持活性，處理這些樣品時(shí)需要格外注意;組織樣品中的RNA在-80℃ 凍存時(shí)仍然不是穩(wěn)定的，有人觀察到5年后RNA出現(xiàn)降解;核酸、蛋白質(zhì)等大分子經(jīng)過反復(fù)凍融，有可能斷裂成較小片段;凍存耗能較多，需要較多門的空間，成本高昂;當(dāng)凍存設(shè)備發(fā)生故障時(shí)，大批珍貴的樣品有可能被破壞，從而導(dǎo)致巨大的損失;當(dāng)用液氮凍存樣品時(shí)，還要防范凍傷、液氮容器爆炸及因空間密閉等導(dǎo)致窒息等風(fēng)險(xiǎn)。

　　3. 凍存溫度的選擇

　　已述及，根據(jù)一般的物理化學(xué)規(guī)律，溫度越低，樣品的穩(wěn)定時(shí)間越長。在超低溫冰箱面世之，-20℃ 冰箱是常用的低溫貯存工具。實(shí)踐證明，-20℃ 時(shí)組織內(nèi)的大分子仍然可以被降解。而且，0至-60℃ 是水的結(jié)晶溫度。結(jié)晶容易對細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)造成傷害，一般不在這一溫度范圍來保存組織和細(xì)胞。一些經(jīng)過提純的大分子可以在這一溫度范圍內(nèi)短期保存。目，大多數(shù)生物和醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)用-80℃ 冰箱或液氮凍存生物樣品。-80℃低于危害性較大的結(jié)晶溫度范圍，也是常用設(shè)備超低溫冰箱能達(dá)到的溫度。但在-80℃溫度下，不同的生物樣品的保存時(shí)間是不一致的。組織中的DNA可以在-80℃下可以保持?jǐn)?shù)年或更長時(shí)間。組織中的RNA在-80℃下的穩(wěn)定性隨不同組織或細(xì)胞而異，但一般不超過5年。一些組織內(nèi)的RNA在-80℃下不到一年就發(fā)生了降解。為了保存組織內(nèi)的RNA，可以將組織切成尺寸小于0.5cm 的小塊，沒入5-10倍體積的RNAsafety?等組織培養(yǎng)液中，置于凍存管內(nèi)，冰凍保存。RNAsafety?溶液能夠較好地維持RNA的完整性。甚至那些已知RNA酶含量較高的組織中的RNA也可以在RNAsafety?保存液中得以凍存。

　　隨著制冷技術(shù)的，深低溫冰箱已經(jīng)出現(xiàn)在某些實(shí)驗(yàn)室。這類冰箱制冷溫度可達(dá)到-150℃。它不需要像液氮罐那樣需要頻繁監(jiān)控液氮消耗情況。箱內(nèi)溫度也比較均勻恒定，但深低溫冰箱降溫速度低于液氮，一旦開啟取放樣品時(shí)容易造成較大范圍的溫度波動(dòng)，溫度恢復(fù)時(shí)間也相對較長。另外深低溫冰箱能耗很大，且必須保障供電。

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