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　　ELISA實驗要點：ELISA原理、類型及操作步驟

　　ELISA的原理

　　ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

　　ELISA方法類型和操作步驟

　　elisa可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。

　　(一)雙抗體夾心法

　　雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

　　(2)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

　　(3)加酶標抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

　　(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。

　　根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

　　(二)雙位點一步法

　　在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

　　(三)間接法測抗體

　　間接法是檢測抗體常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

　　(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。

　　(3)加酶標抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

　　(4)加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

　　本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。

　　(四)競爭法

　　競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

　　(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

　　(2)待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結(jié)合的機會，使酶標抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結(jié)合可達充分的量。洗滌。

　　(3)加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標抗原多，故顏色深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

　　(五)捕獲法測IgM抗體

　　血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：

　　(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

　　(2)加入稀釋的血清標本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

　　(3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。

　　(4)加入針對特異性的酶標抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。

　　(5)加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應(yīng)。

　　(六)應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司