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　　BUNSEN本生分享：pcr實驗原理及詳細操作步驟

　　實驗方法原理

　　基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

　　PCR由變性－－退火－－延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備;

　　②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;

　�、垡�物的延伸：DNA模板－－引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

　　重復(fù)循環(huán)變性－－退火－－延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　實驗材料 模板DNA

　　試劑、試劑盒 dNTPTaq DNA聚合酶蒸餾水PCR緩沖液引物氯化鎂

　　儀器、耗材 PCR儀 移液槍 PCR板 薄壁管 離心管 離心管盒

　　實驗步驟

　　一、標準的PCR反應(yīng)體系

　　10×擴增緩沖液 　 10 ul

　　4種dNTP混合物 　 各200 umol/L

　　引物 　　　　 　 各10～100 pmol

　　模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

　　Taq DNA聚合酶 　 2.5 u

　　Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L

　　加雙或三蒸水至 　 100 ul

　　二、PCR引物設(shè)計

　　PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準)，5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

　　1. 引物設(shè)計的基本原則

　　(1) 引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。

　　(2) 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC zui好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　(3) 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。

　　(4)兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

　　(5) 引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有*互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。

　　(6)引物3‘端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，jia選擇是G和C。

　　(7) 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高xin標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

　　2. 引物設(shè)計軟件

　　Primer Premier5.0 (自動搜索)*、Oligo6 (引物評價)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在線服務(wù))。

　　三、模板的制備

　　(1)PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

　　(2)模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫(yī)學標本有血斑、精斑、毛發(fā)等。

　　(3)標本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、lv仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

　　四、PCR反應(yīng)條件的控制

　　1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。

　　2. 鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。

　　3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。

　　4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。

　　5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。

　　6. 反應(yīng)溫度

　　(1)變性溫度和時間95℃，30 s。

　　(2)退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

　　(3)延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi))。

　　(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

　　7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。

　　五、PCR的循環(huán)參數(shù)

　　1. 預(yù)變性(Initial denaturation)

　　模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

　　2. 循環(huán)中的變性步驟

　　循環(huán)中一般95℃，30足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴增失敗。

　　3. 引物退火(Primer annealing)

　　退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預(yù)估。

　　退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

　　4. 引物延伸

　　引物延伸一般在72℃進行(Taq酶適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略

　　延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

　　5. 循環(huán)數(shù)

　　大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。

　　6. 后延伸

　　在后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

　　六、PCR步驟

　　1. DNA變性

　　(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

　　2. 退火

　　(25℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

　　3. 延伸

　　(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性*)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

　　七、PCR檢測

　　PCR反應(yīng)擴增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素(溴化乙錠，EB)染色凝膠電泳是常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

　　注意事項

　　1. 由于PCR反應(yīng)靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中。

　　2. 如果是公用的、沒有密碼保護的PCR儀，經(jīng)常檢查PCR儀上的程序正確與否。

　　3. 不使用過量試劑“less is usually better (more specific)”。

　　4. 試劑購回后應(yīng)分裝成小份使用，這樣一旦有污染發(fā)生，可以立即丟棄污染的試劑，不會造成大的損失;試劑分裝也有助于減少反復(fù)凍融次數(shù)(例如dNTPs對反復(fù)凍融敏感)。

　　5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以充分混勻。

　　6. 使用陰性對照檢查污染的發(fā)生。

　　7. 使用陽性對照(能良好擴增的樣本)。

　　8. 電泳時使用DNA分子量標準品(指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失敗)。

　　9. 當擴增很長的、GC含量高的模板時或容易產(chǎn)生二結(jié)構(gòu)的模板時適量使用添加劑(glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度;glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用;DMSO 減少二結(jié)構(gòu)的發(fā)生，并通過減弱非特異性引物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的特異性)。

　　10. 不使用帶有自動除霜功能的冰箱存儲酶(避免反復(fù)凍融)，每次取酶時都使用新的槍頭酶，酶使用后應(yīng)立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導(dǎo)致酶變性失活。

　　11. PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間，一般為48 h以內(nèi)，有些zui好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

　　收起

　　其他

　　一、 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

　　1. 模板核酸的制備。

　　2. 引物的質(zhì)量與特異性。

　　3. 酶的質(zhì)量。

　　4. PCR循環(huán)條件。

　　二、 PCR常見問題及對策

　　1. 假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶

　　(1)模板原因

　�、� 模板中含有雜蛋白質(zhì)。

　�、� 模板中含有Taq酶抑制劑。

　　③ 模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。

　�、� 在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。

　�、� 模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

　　(2)酶失活

　�、� 需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。

　�、� 忘加Taq酶或溴乙錠。

　　(3)引物

　�、� 引物質(zhì)量。

　�、� 引物的濃度。

　�、� 兩條引物的濃度是否對稱。

　　解策：

　�、� 選定一個好的引物合成單位。

　�、� 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

　�、� 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

　�、� 引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

　　(4)Mg2+濃度

　�、� 濃度過高降低PCR擴增的特異性。

　�、� 濃度過低影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

　　(5)反應(yīng)體積的改變

　　① 通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定;

　�、� 在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

　　(6)物理原因

　�、� 變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，有可能出現(xiàn)假陰性。

　�、� 退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率;退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。

　　③ 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題。

　　(7)靶序列變異

　�、� 靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。

　　② 靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列。

　　2. 假陽性，出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

　　(1)引物設(shè)計不合適

　�、� 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性。

　�、� 靶序列太短或引物太短。

　　(2)靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

　�、� 整個基因組或大片段的交叉污染。

　　解決方案：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標本，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

　�、� 空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。

　　解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除。

　　3. 出現(xiàn)非特異性擴增：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。

　　(1) 引物與靶序列不*互補或引物聚合形成二聚體。

　　(2) Mg2+離子濃度過高。

　　(3) 退火溫度過低。

　　(4) PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。

　　(5) 酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。

　　其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

　　4. 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

　　(1)原因

　�、� 酶量過多。

　�、� 酶的質(zhì)量差。

　�、� dNTP濃度過高。

　　④ Mg2+濃度過高。

　　⑤ 退火溫度過低。

　�、� 循環(huán)次數(shù)過多引起。

　　(2)對策。

　�、� 減少酶量。

　　② 調(diào)換另一來源的酶。

　�、� 減少dNTP的濃度。

　　④ 適當降低Mg2+濃度。

　�、� 增加模板量。

　�、� 減少循環(huán)次數(shù)。

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