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　　ELISA檢測(cè)操作注意事項(xiàng)及解決方案匯總
 

　　以下是影響ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵因素，也是眾多ELISA 用戶在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到的問(wèn)題及解決方案：

　　問(wèn)題：為什么所有試劑和檢測(cè)樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作?

　　解決方案：溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測(cè)樣本。避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

　　問(wèn)題：為什么標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差?

　　解決方案：按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品;溶解標(biāo)準(zhǔn)品之需短暫離心，*收集粉末;確保標(biāo)準(zhǔn)品*溶解和混勻(大約10min)，然后再進(jìn)行后續(xù)的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且移液;顯色的恰當(dāng)終止;選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　問(wèn)題：ELISA實(shí)驗(yàn)為什么必須設(shè)置復(fù)孔?

　　解決方案：為獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)。

　　因?yàn)閺?fù)孔檢測(cè)可以：

　　計(jì)算平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確;

　　解決實(shí)驗(yàn)中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;

　　計(jì)算CV值，對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評(píng)估。

　　問(wèn)題：為什么實(shí)驗(yàn)過(guò)程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?

　　解決方案：振蕩孵育使反應(yīng)更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標(biāo)96孔微孔板振蕩器。

　　孵育過(guò)程振蕩，可以加快、加強(qiáng)抗原抗體間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過(guò)程更加*，OD值通常會(huì)比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過(guò)程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值，同時(shí)可以提高試劑盒檢測(cè)的靈敏度。

　　問(wèn)題：何時(shí)終止ELISA反應(yīng)?

　　解決方案：ELISA實(shí)驗(yàn)zui終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來(lái)完成，在zuijia時(shí)間終止反應(yīng)是ELISA實(shí)驗(yàn)成功的重要因素。在HRP-TMB酶反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)zui高濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色不再變深，倒數(shù)2-3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色開(kāi)始有淺藍(lán)色時(shí)，便需要終止反應(yīng);或者也可以根據(jù)zui高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在620nm的OD值來(lái)決定，OD620=0.9-0.95之間時(shí)即可終止。

　　問(wèn)題：為什么酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)必須選用雙波長(zhǎng)?

　　解決方案：先，酶標(biāo)儀使用務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，可以排除單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)的測(cè)定干擾(標(biāo)本的濃度，干擾色等)。一般采用zui大波長(zhǎng)作為參照波長(zhǎng)，在參照波長(zhǎng)下，檢測(cè)物的吸光值z(mì)ui小，檢測(cè)波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此，雙波長(zhǎng)測(cè)定，可zui大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來(lái)的誤差，以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司