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　　本生快訊| 影響 PCR 反應(yīng)的五大要素您知道多少?
 

　　PCR 反應(yīng)的五要素

　　1、引物

　　引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA 互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用 PCR 就可將模板 DNA 在體外大量擴(kuò)增。

　　設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

　�、僖�物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為 20bp 左右。

　�、谝�物擴(kuò)增跨度： 以 200-500bp 為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至 10kb 的片段。

　�、垡�物堿基：G+C 含量以 40-60% 為宜，G+C 太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC 蕞 hao 隨機(jī)分布，避免 5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是 3＇ 端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

　�、菀�物 3＇ 端的堿基，特別是蕞末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致 PCR 失敗。

　�、抟�物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列 hao 有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

　　⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度 0.1～1umol 或 10～100pmol，以蕞低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

　　2、酶

　　目有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應(yīng)約需酶量 2.5U(指總反應(yīng)體積為 100ul 時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。

　　3、dNTP

　　dNTP 的質(zhì)量與濃度和 PCR 擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP 粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP 溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的緩沖液將其 PH 調(diào)節(jié)到 7.0～7.5，小量分裝， -20℃ 冰凍保存。多次凍融會(huì)使 dNTP 降解。

　　在 PCR 反應(yīng)中，dNTP 應(yīng)為 50～200umol/L，尤其是注意 4 種 dNTP 的濃度要相等 ( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí) (偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP 能與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。

　　4、模板

　　模板核酸的量與純化程度，是 PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS 的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA 結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與 lv 仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR 反應(yīng)。

　　一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于 PCR 擴(kuò)增。RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。

　　5、Mg2+濃度

　　Mg2+對(duì) PCR 擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時(shí)，Mg2+濃度為 1.5～2.0 mmol/L 為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

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