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　　人凋亡相關(guān)因子 ELISA試劑盒技術(shù)資料詳解
 

　　適用于人血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液等樣本

　　介紹：

　　Fas，又稱 APO-1 或 CD 95，屬于 NGF 和 TNF 受體超家族成員，是一種細胞表面受體，通過 Fas 配體(FasL)傳遞凋亡信號。Fas 分子的基因定位于第 10 號染色體長臂，基因長度大約 25kb，含有 9 個外顯子，F(xiàn)as 分子是由 325 個氨基酸組成的分子量 45kDa 的 I 型跨膜糖蛋白，它與 TNF RI(稱為死亡域)共有一個細

　　胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，結(jié)合胞質(zhì)信號分子觸發(fā)胞質(zhì)凋亡信號。Fas 在活化的 T、B 淋巴細胞和惡性淋巴樣細胞上有很大程度的表達。在較小程度上，F(xiàn)as 在肝臟、心臟、腎臟、卵巢和許多其他惡性細胞上表達。患有自身免疫性淋巴增生性綜合征的人有 Fas 突變。可溶性 Fas(SFas)起源于交替剪接的 mRNA，導(dǎo)致單個跨膜結(jié)構(gòu)域的

　　缺失或破壞。膜囊泡的脫落也可引起血漿 Fas 的產(chǎn)生，從而抑制 FasL 誘導(dǎo)的細胞凋亡。

　　檢測原理：

　　BUNSEN本生ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗人Fas/Apo-1/CD95 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上;分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 Fas/Apo-1/CD95會與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合;洗板后加入生物素化抗人 Fas/Apo-1/CD95抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人 Fas/Apo-1/CD95 發(fā)生特異性結(jié)合;洗板后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合;洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的人 Fas/Apo-1/CD95，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺(正相關(guān))的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色;，在λmax=450 nm(OD=450 nm)處測定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD)，樣本中的人 Fas/Apo-1/CD95 濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中人 Fas/Apo-1/CD95 的濃度。

　　原理圖：

　　注意事項：

　　1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。

　　2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。

　　3. 試劑盒使用請在室溫恢復(fù) 30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

　　4. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。

　　5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜(※)及潔凈塑料容器。

　　6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用請離心處理(5-10 S 即可)，使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。

　　7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

　　8. 為結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　人凋亡相關(guān)因子 ELISA試劑盒安全提示：

　　試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護;在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗;檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

　　試劑盒組成及儲存：

　　1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 ; 2 酶標(biāo)試劑 6ml×1 瓶

　　3 酶標(biāo)包被板 12 孔×8 條 ; 4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶

　　5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 ; 6 顯色劑B 液 6ml×1/瓶

　　7 終止液 6ml×1 瓶; 8 標(biāo)準(zhǔn)品(48ng/ml) 0.5ml×1 瓶

　　9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶; 10 說明書 1 份

　　11 封板膜 2 張; 12 密封袋 1 個

　　自備實驗器材(不提供，可代購)

　　1. 酶標(biāo)儀(主波長 450nm，參考波長 630nm)

　　2. 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

　　3. 洗板機或洗瓶

　　4. 37℃孵育箱

　　5. 雙蒸水，去離子水，量筒等

　　6. 稀釋用聚丙烯試管

　　樣本收集及儲存：

　　1. 細胞培養(yǎng)上清：

　　將細胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存)，避免反復(fù)凍融。

　　2. 血清樣本：

　　室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存)，保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。

　　3. 血漿樣本：

　　將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存)，避免反復(fù)凍融。

　　※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果;如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。

　　試劑準(zhǔn)備：

　　1. 試劑回溫：先在實驗 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

　　2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

　　3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為4000pg/ml)，然后按照以下濃度進行2倍稀釋：4000、2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml進行稀釋，4000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線點濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(0pg/ml)。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(4000pg/ml)未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

　　4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液(SR2)將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋充分混勻)，請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

　　5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液(SR3)將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋離心)，請在30分鐘內(nèi)使用。

　　6. 洗滌方法：

　　 自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔，注與吸出間隔為 30 ，洗板 5 次。

　　 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止30 后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

　　結(jié)果判斷：

　　1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

　　2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。

　　3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中Fas/Apo-1/CD95含量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

　　4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

　　人凋亡相關(guān)因子 ELISA試劑盒參數(shù)表征：

　　1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算人 Fas/Apo-1/CD95 的樣本含量。

　　2. 靈敏度：

　　可檢測人 Fas/Apo-1/CD95 濃度達 31pg/ml，

　　20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

　　3. 特異性：

　　不與人 Fas Ligand、 FGF acidic 、FGF basic 、FGF-4 、FGF-5、 FGF-6、 G-CSF 、GM-CSF、 gp130 、GROα，小鼠 IL-1β、 IL-3、 IL-4 、IL-5、 IL-6 、IL-7、 IL-9、 IL-10、 IL-13 等反應(yīng)。

　　4. 重復(fù)性：

　　板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。

　　5. 回收率：

　　在選取的健康人血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人 Fas/Apo-1/CD95，計算回收率。

　　6. 線性稀釋：

　　分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 Fas/Apo-1/CD95，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。

　　人凋亡相關(guān)因子 ELISA試劑盒 本生(天津)健康科技有限公司是一家從事健康科技技術(shù)開發(fā)銷售的公司，本生生物公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)。本生(天津)健康科技有限公司由具有行業(yè)背景和豐富市場經(jīng)驗的業(yè)人士組成，于為生命科學(xué)研究域提供產(chǎn)品，為廣大科研工作者提供服務(wù)。 既能滿足研發(fā)類客戶對產(chǎn)品種類、包裝的特殊要求，也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)�；�生產(chǎn)各個階段的綜合需求。

原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司