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BUNSEN本生ELISA技術(shù)大詳解!2023動態(tài)已更新
閱讀次數(shù):15338 發(fā)布時間:2023/3/21 10:43:34
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  BUNSEN本生ELISA技術(shù)大詳解!
 

  ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。

  這種測定方法中有三個必要的試劑:

  (1)固相的抗原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent)

  (2)酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"(conjugate)

  (3)酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件,可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法

  雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法。

  ELISA操作步驟如下:

  1) 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

  2) 加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

  3) 加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。

  4) 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,測知標(biāo)本中抗原的量。

  雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。

  【雙抗夾心法測抗體】

  反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測定,因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。

  【直接法測抗體】

  間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。

  ELISA操作步驟如下:

  1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

  2)加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

  3)加酶標(biāo)抗抗體?捎酶標(biāo)抗人Ig以檢測總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。

  4)加底物顯色

  本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

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